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IDT Alt-R™ CRISPR-Cas12a(Cpf1)基因編輯系統(tǒng)工具
——crRNA化學(xué)定制合成,重組Cas12a核酸酶

 
北京澤平代理的進口IDT(Integrated DNA Technologies)Alt-R™ CRISPR-Cas12a(Cpf1)基因編輯系統(tǒng),提供CRISPR-Cas12a(Cpf1)中crRNA(CRISPR-derived RNA)的化學(xué)合成定制服務(wù),并生產(chǎn)商品化通用型重組Cas12a核酸酶(Cas12a nuclease,即Cpf1核酸酶,限制性內(nèi)切酶,基因組DNA雙鏈剪切)、以及增強RNP(ribonucleoprotein,核糖核蛋白復(fù)合體)電轉(zhuǎn)染效率的電穿孔增強劑、增強HDR(Homology directed repair,同源重組修復(fù))概率的HDR增強劑、HDR供體DNA的化學(xué)合成服務(wù),提供多重基因組編輯所需全套試劑的工具平臺,為因物種基因組富含A、T、DNA靶點不合適而無法使用常規(guī)IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9系統(tǒng),提供了更多選擇。




 
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IDT Alt-R CRISPR-Cas12a(Cpf1)系統(tǒng)crRNA、Cas12(Cpf1)核酸酶電穿孔增強劑、HDR增強劑、HDR DNA供體
IDT Alt-R CRISPR-Cas9系統(tǒng)


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IDT Alt-R™ CRISPR-Cas12a(Cpf1)概述

IDT的Alt-R™ CRISPR-Cas12a(Cpf1)系統(tǒng),對crRNA序列進行優(yōu)化縮短、化學(xué)修飾,對Cas12a(Cpf1)核酸酶結(jié)構(gòu)域進行優(yōu)化,獲得了高保真的雙鏈剪切功能,使用時僅需混合crRNA和Cas12a(Cpf1)核酸酶,再通過電穿孔(如Lonza Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng))轉(zhuǎn)染RNP,可進行精確地基因編輯操作。

傳統(tǒng)構(gòu)建CRISPR-Cas12a(Cpf1)質(zhì)粒的方法,質(zhì)粒大小高達6-10kb,很難轉(zhuǎn)染,而如使用原代細胞等難轉(zhuǎn)染的細胞,轉(zhuǎn)染效率更低。且質(zhì)粒不斷產(chǎn)生CRISPR-Cas12a,使脫靶率顯著增加。IDT轉(zhuǎn)染RNP蛋白復(fù)合體的方法,通過優(yōu)化CRISPR-Cas12a(Cpf1)組件,在提升剪切精確性的基礎(chǔ)上,提高轉(zhuǎn)染效率、減少細胞毒性、降低脫靶率,進而提高了基因編輯效率。


 

 



 
IDT Alt-R™ CRISPR-Cas12a(Cpf1)產(chǎn)品
 

1、Cas12a(Cpf1)核酸酶

Alt-R™ Cas12a(Cpf1)核酸酶,添加核定位序列(Nuclear localization sequence,NLS),經(jīng)序列優(yōu)化,提高中靶率,降低脫靶率。V3酶和Ultra酶均可識別TTTV,而Ultra核酸酶增加了對TTTT的PAM(前間區(qū)序列鄰近基序,protospacer adjacent motif)識別。注:V=A、C、G

貨號 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 備注
1081068 Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) V3, 100 µg 100 µg 識別TTTV位點,10 µg/µL,100 µg = 633 pmol
1081069 Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) V3, 500 µg 500 µg
10001272 Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra, 100 µg 100 µg 識別TTTN位點,N表示A、T、C、G堿基
10001273 Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra, 500 µg 500 µg
10007804 Alt-R™ A.s. Cas12a (Cpf1) Ultra, 5 mg 5 mg
10007922 Alt-R™ L.b. Cas12a (Cpf1) Ultra, 100 µg 100 µg 識別TTTN位點,10 µg/µL,100 µg = 670 pmol
10007923 Alt-R™ L.b. Cas12a (Cpf1) Ultra, 500 µg 500 µg
10007924 Alt-R™ L.b. Cas12a (Cpf1) Ultra, 5 mg 5 mg


 

 

2、crRNA(定制)

Alt-R™ Cas12a crRNA,定制合成的crRNA,包含20-24nt的特異性序列(定制)和20nt的通用序列,相比野生型,序列更短,中靶率更高。經(jīng)化學(xué)修飾防止被細胞核糖核酸酶降解。需要與Cas12a(Cpf1)核酸酶結(jié)合形成RNP復(fù)合體。

貨號 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 備注
定制 Alt-R™As Cas12a crRNA,2 nmol 2 nmol 40-45bp,與As.cas12a酶結(jié)合使用
定制 Alt-R™As Cas12a crRNA,10 nmol 10 nmol
定制 Alt-R™ L.b. Cas12a crRNA, 2 nmol 2 nmol 40-45bp,與L.b.cas12a酶結(jié)合使用
定制 Alt-R™ L.b. Cas12a crRNA, 10 nmol 10 nmol

 

 

 



 
3、電穿孔增強劑

Alt-R™ Cas12a電穿孔Enhancer,是Cas12a特異性的載體DNA,當使用原代細胞或難轉(zhuǎn)染細胞系時,可提高Lonza(原Amaxa)Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)等電穿孔設(shè)備的對RNP的轉(zhuǎn)染效率,進而提高實驗效率。

貨號 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 備注
1076300 Alt-R™ Cpf1 Electroporation Enhancer, 2 nmol 2 nmol 電穿孔增強劑,增強轉(zhuǎn)染效率
1076301 Alt-R™ Cpf1 Electroporation Enhancer, 10 nmol 10 nmol


 
 


4、HDR增強劑

Alt-R™ HDR Enhancer,小分子化合物,可提高同源重組修復(fù)概率。在包括貼壁、懸浮的大量細胞系中均有活性,可用于Cas12a(Cpf1)核酸酶、Cas9核酸酶。

貨號 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 備注
10007910 Alt-R™ HDR Enhancer V2, 30 µL 30 µL HDR增強劑,增加同源重組修復(fù)傾向性
10007921 Alt-R™ HDR Enhancer V2, 150 µL 150 µL
1081072 Alt-R™ HDR Enhancer, 100 µL 100 µL
1081073 Alt-R™ HDR Enhancer, 500 µL 500 µL

 

 




5、供體DNA(定制)

Alt-R™ HDR供體寡核苷酸:專門為同源重組修復(fù)基因敲入開發(fā),具有比標準寡核苷酸更高的穩(wěn)定性和更高的摻入率。

貨號 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 備注
定制 Alt-R HDR Donor Oligo, 2 nmol 2 nmol 45-200nt,Alt-R修飾和硫代磷酸酯PS修飾
定制 Alt-R HDR Donor Oligo, 10 nmol 10 nmol
定制 Alt-R™ HDR Donor Block, 201-500 bp, 3 µg 3 µg 非常適合進行段基因組的修改和插入;帶修飾雙鏈DNA
定制 Alt-R™ HDR Donor Block, 201-500 bp, 10 µg 10 µg
定制 Alt-R™ HDR Donor Block, 501-2000 bp, 3 µg 3 µg
定制 Alt-R™ HDR Donor Block, 501-2000 bp, 10 µg 10 µg
定制 Alt-R™ HDR Donor Block, 2001-3000 bp, 3 µg 3 µg
定制 Alt-R™ HDR Donor Block, 2001-3000 bp, 10 µg 10 µg

 

 

 


 

 

IDT Alt-R™ CRISPR-Cas12a(Cpf1)實驗流程

1、設(shè)計crRNA,使其間隔區(qū)(Spacer)序列與DNA靶序列互補,提交給IDT定制合成crRNA;
2、將crRNA與Cas12a(Cpf1)核酸酶混勻,形成核糖核蛋白體(ribonucleoprotein,簡稱RNP);
3、將RNP通過電轉(zhuǎn)染等導(dǎo)入細胞或細胞核;
4、通過crRNA的Spacer識別DNA靶序列,通過Cas12a蛋白識別PAM序列,對DNA進行剪切;
5、對DNA斷裂處進行修復(fù)
①進行非同源末端連接修復(fù)(Non-homologous end-joining,簡稱NHEJ),實現(xiàn)基因敲除(knockout);
②(使用IDT序列設(shè)計工具)設(shè)計供體DNA模板,進行同源重組修復(fù)(Homology directed repair,簡稱HDR),實現(xiàn)基因敲入(knockoin)、基因敲除、基因沉默等。









 



  

IDT Alt-R™ crRNA序列設(shè)計示意圖


 

 

 


Cas12a系統(tǒng)和Cas9系統(tǒng)區(qū)別和應(yīng)用

 

IDT Alt-R™ CRISPR Alt-R™ CRISPR-Cas12a(Cpf1)系統(tǒng) Alt-R™ CRISPR-Cas9系統(tǒng)
Alt-R™ Cas12a V3核酸酶 Alt-R™ Cas12a Ultra核酸酶 Alt-R™ Cas9核酸酶 Alt-R™ Cas9切口酶
特點 通用Cas12a酶,富含AT的物種,或使用CRISPR-Cas9有限制 經(jīng)序列優(yōu)化的Cas12a酶,比Cas12a通用型性能更佳 通用Cas9酶,易于使用且經(jīng)濟實惠 突變的Cas9酶,保留單鏈切割能力
PAM識別 TTTV TTTN NGG
DNA切割 雙鏈 雙鏈 單鏈
末端 5’突出 平末端 5’突出/3‘突出
建議用途 無法使用Cas9的實驗 需要高基因編輯效率的實驗 一般實驗 適用于同時使用2種crRNA,各自識別并切割2條鏈中一條,通過將spacer由20nt提高到40nt,實現(xiàn)更高特異性
規(guī)格 100 μg或500 μg
Cas12a+crRNA crRNA 20-24nt特異性序列(推薦使用21nt),20nt通用序列 \
Cas9+gRNA crRNA \ 19-20nt特異性序列(推薦使用20nt),16nt通用序列
tracrRNA \ 67nt通用序列
Cas9+sgRNA sgRNA \ 19-20nt特異性序列(推薦使用20nt),80nt通用序列,經(jīng)過序列修飾,不會引起細胞免疫反應(yīng),不會激活無關(guān)的基因




注:
N=任意堿基
V=A、C、G


 

 


 

參考文獻

1.Conformational Activation Promotes CRISPR-Cas12a Catalysis and Resetting of the Endonuclease Activity. Stefano Stella,et al., Cell, Volume 175, Issue 7, 13 December 2018, Pages 1856-1871.e21
2. Switching the activity of Cas12a using guide RNA strand displacement circuits
. Lukas Oesinghaus & Friedrich C. Simmel, Nature Communications volume 10, Article number: 2092 (2019)
3. Sequence-Specific Recognition of HIV-1 DNA with Solid-State CRISPR-Cas12a-Assisted Nanopores (SCAN). Reza Nouri,et al., ACS Sens. 2020, 5, 5, 1273–1280
4. Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Cas12a assay. Xiong Ding,et al., Nature Communications volume 11, Article number: 4711 (2020)
5. Broad-spectrum enzymatic inhibition of CRISPR-Cas12a. Gavin J. Knott,et al., Nature Structural & Molecular Biology volume 26, pages315–321(2019)
6. Structural Basis for the Inhibition of CRISPR-Cas12a by Anti-CRISPR Proteins. HengZhang,et al.,Cell Host & Microbe, Volume 25, Issue 6, 12 June 2019, Pages 815-826.e4
7. Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a. Isabel Strohkendl,et al., Molecular Cell,Volume 71, Issue 5, 6 September 2018, Pages 816-824.e3



 

 
 


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——IDT中國一級代理商,北京澤平

 



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