IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)工具
——crRNA、sgRNA化學(xué)定制合成，商品化重組Cas9核酸酶、重組dCas9蛋白
北京澤平代理的進口IDT（Integrated DNA Technologies）Alt-R™ CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，提供免費序列設(shè)計工具，提供化學(xué)合成CRISPR-Cas9中crRNA（CRISPR-derived RNA）、sgRNA（small guide RNA）的定制合成服務(wù)，并生產(chǎn)商品化通用型tracrRNA（trans-activating crRNA）、化膿性鏈球菌S. pyogene來源并由E.coli大腸桿菌表達的高保真或熒光修飾的重組Cas9核酸酶（Cas9 nuclease，限制性內(nèi)切酶，基因組DNA雙鏈剪切）、重組Cas9切口酶（Cas9 nickase，即缺口酶，對靶鏈、或非靶鏈進行DNA單鏈剪切）、重組dCas9蛋白（無剪切功能，靶點占位蛋白，用于CRISPRi）、以及增強RNP（ribonucleoprotein，核糖核蛋白復(fù)合體）電轉(zhuǎn)染效率的電穿孔增強劑、增強HDR（Homology directed repair，同源重組修復(fù)）概率的HDR增強劑、HDR供體DNA的化學(xué)合成服務(wù)，提供從設(shè)計到多重基因組編輯、CRISPR干擾等試劑的工具平臺。
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▲IDT Alt-R CRISPR-Cas9系統(tǒng)（crRNA、tracrRNA、sgRNA、Cas9核酸酶、Cas9切口酶、dCas9蛋白、電穿孔增強劑、HDR增強劑、HDR DNA供體）
▲IDT Alt-R CRISPR-Cas12a/Cpf1系統(tǒng)
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IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9概述
IDT的Alt-R™ CRISPR-Cas9系統(tǒng)，分別對crRNA、tracrRNA、sgRNA序列進行優(yōu)化縮短、化學(xué)修飾，對化膿性鏈球菌S. pyogene Cas9內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域進行突變，獲得了高精確性的單鏈、雙鏈剪切功能，再通過電穿孔（如Lonza Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)）轉(zhuǎn)染RNP，可進行精確地基因編輯操作。
傳統(tǒng)構(gòu)建CRISPR-Cas9質(zhì)粒的方法，質(zhì)粒大小高達6-10kb，很難轉(zhuǎn)染，而如使用原代細胞等難轉(zhuǎn)染的細胞，轉(zhuǎn)染效率更低。且質(zhì)粒不斷產(chǎn)生CRISPR-Cas9，使脫靶率顯著增加。IDT轉(zhuǎn)染RNP蛋白復(fù)合體的方法，通過優(yōu)化CRISPR-Cas9組件，在提升剪切精確性的基礎(chǔ)上，提高轉(zhuǎn)染效率、減少細胞毒性、降低脫靶率，進而提高了基因編輯效率。
IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9產(chǎn)品
1、Cas9核酸酶
Alt-R™ Cas9核酸酶，S. pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達純化，添加NLS（Nuclear localization sequence，NLS）和C端6-His標簽。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9核酸酶=610pmol。
| 貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 1081058 |
Alt-R™ S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 µg |
100 µg |
野生型，10 µg/µL，100 µg = 610 pmol. |
| 1081059 |
Alt-R™ S.p. Cas9 Nuclease V3, 500 µg |
500 µg |
| 10000735 |
Alt-R™ S.p. Cas9 Nuclease V3, 5 mg |
5 mg |
Alt-R™ HiFi Cas9高保真核酸酶，經(jīng)序列優(yōu)化，顯著提高中靶率，是常規(guī)實驗的更佳選擇，非常適合棘手的基因組編輯應(yīng)用。
| 貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 1081060 |
Alt-R™ S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 µg |
100 µg |
高保真，10 µg/µL，100 µg = 610 pmol |
| 1081061 |
Alt-R™ S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 500 µg |
500 µg |
| 10007803 |
Alt-R™ S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 5 mg |
5 mg |
Alt-R™ Cas9-GFP核酸酶、Alt-R™ Cas9-RFP核酸酶，具有NLS和C端6-His標簽。添加GFP綠色熒光、或RFP紅色熒光修飾，專為需要蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染后可視化、或使用熒光激活細胞分選 (FACS) 富集編輯細胞的應(yīng)用設(shè)計。
| 貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 10008100 |
Alt-R™ S.p.Cas9-GFP V3, 100 µg |
100 µg |
GFP標簽，10 µg/µL，100 µg = 530 pmol. |
| 10008161 |
Alt-R™ S.p.Cas9-GFP V3, 500 µg |
500 µg |
| 10008162 |
Alt-R™ S.p.Cas9-RFP V3, 100 µg |
100 µg |
RFP標簽，10 µg/µL，100 µg = 530 pmol. |
| 10008163 |
Alt-R™ S.p.Cas9-RFP V3, 500 µg |
500 µg |
Alt-R™ Cas9核酸酶（不含甘油），具有NLS和C端6-His標簽。以10µg/µL的無甘油溶液形式提供。
| 貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 10007806 |
Alt-R™ S.p.Cas9 V3, glycerol-free, 100µg |
100 µg |
無甘油，10 µg/µL，100 µg = 610 pmol |
| 10007807 |
Alt-R™ S.p.Cas9 V3, glycerol-free, 500µg |
500 µg |
| 10007808 |
Alt-R™ S.p.Cas9 V3, glycerol-free, 5mg |
5 mg |
2、Cas9切口酶
Alt-R™ Cas9切口酶/缺口酶，S. pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達純化，添加NLS和C端6-His標簽。其中Alt-R™ Cas9 D10A切口酶中RuvC-like內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域功能失活，對DNA靶向鏈進行單鏈切割。Alt-R™ Cas9 H840A切口酶，HNH結(jié)構(gòu)域失活，對非靶向鏈單鏈切割。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9切口酶=610pmol。
| 貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 1081062 |
Alt-R™ S.p. Cas9 D10A Nickase V3, 100 µg |
100 µg |
缺口酶，切割靶向鏈（不包含PAM的鏈） |
| 1081063 |
Alt-R™ S.p. Cas9 D10A Nickase V3, 500 µg |
500 µg |
| 1081064 |
Alt-R™ S.p. Cas9 H840A Nickase V3, 100 µg |
100 µg |
缺口酶，切割非靶向鏈（包含PAM的鏈） |
| 1081065 |
Alt-R™ S.p. Cas9 H840A Nickase V3, 500 µg |
500 µg |
3、dCas9蛋白
Alt-R™ dCas9占位蛋白，S. pyogene來源Cas9，大腸桿菌表達純化，喪失內(nèi)切酶功能，添加NLS和C端6-His標簽。dCas9蛋白可用于CRISPRi，進行基因下調(diào)（knockdown）等，相比RNAi，由于CRISPRi需要在轉(zhuǎn)錄起始位點附近才能發(fā)揮功能，其脫靶率遠低于RNAi。Alt-R™ dCas9蛋白，以10μg/μL的溶液提供。100μg dCas9蛋白=610pmol。
| 貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 1081066 |
Alt-R™ S.p. dCas9 Protein V3, 100 µg |
100 µg |
無切割活性 |
| 1081067 |
Alt-R™ S.p. dCas9 Protein V3,500 µg |
500 µg |
4、crRNA（定制）
Alt-R™ crRNA，由19-20nt特異性序列（定制）和16nt通用序列融合形成，相比野生型，序列更短，中靶率更高。經(jīng)化學(xué)修飾防止被細胞核糖核酸酶降解，必須與tracrRNA一起使用以形成gRNA。
Alt-R™ crRNA XT，相比Alt-R™ crRNA，經(jīng)其他化學(xué)修飾，用于高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的實驗，可提高基因編輯的穩(wěn)定性。必須與tracrRNA一起使用。
| 貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 定制 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol |
2 nmol |
36nt，帶Alt-R修飾，與tracrRNA結(jié)合使用 |
| 定制 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA, 10 nmol |
10 nmol |
| 定制 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA, 50 nmol |
50 nmol |
| 定制 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA, 100 nmol |
100 nmol |
| 定制 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA XT, 2 nmol |
2 nmol |
36nt，比crRNA多了額外化學(xué)修飾，更穩(wěn)定 |
| 定制 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 crRNA XT, 10 nmol |
10 nmol |
5、sgRNA（定制）
Alt-R™ sgRNA，由crRNA和tracrRNA序列融合組成的單個RNA，含有19-20nt的特異性序列（定制）和80nt通用序列，經(jīng)化學(xué)修飾，穩(wěn)定性更高，用于高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的實驗。相比體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA，減少細胞免疫反應(yīng)，更小細胞毒性。
| 貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 定制 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 sgRNA, 2 nmol |
2 nmol |
100nt，兩端有2’OMe 堿基和硫代磷酸酯PS修飾 |
| 定制 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 sgRNA, 10 nmol |
10 nmol |
| 定制 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 sgRNA, 50 nmol |
50 nmol |
| 定制 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 sgRNA, 100 nmol |
100nmol |
6、tracrRNA
Alt-R™ tracrRNA，通用67nt序列，遠遠短于野生型的89nt，縮短后性能提高，經(jīng)化學(xué)修飾，具有核酸酶抗性。可提供熒光標記，測定轉(zhuǎn)染效率。必須與crRNA一起使用以形成gRNA。
| 貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 1072532 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 tracrRNA, 5 nmol |
5 nmol |
67nt，與crRNA結(jié)合使用 |
| 1072533 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol |
20 nmol |
| 1072534 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 tracrRNA, 100 nmol |
100 nmol |
| 1075927 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 tracrRNA, ATTO™ 550, 5 nmol |
5 nmol |
67nt，帶ATTO熒光 |
| 1075928 |
Alt-R™ CRISPR-Cas9 tracrRNA, ATTO™ 550, 20 nmol |
20 nmol |
圖.穩(wěn)定表達Cas9蛋白的HEK-293細胞，轉(zhuǎn)染Alt-R™ crRNA(未標記):tracrRNA(標記)，轉(zhuǎn)染后48小時，熒光顯微鏡下10倍放大。
7、電穿孔增強劑
Alt-R™ Cas9電穿孔Enhancer，是Cas9特異性的載體DNA，當使用原代細胞或難轉(zhuǎn)染細胞時，可提高Lonza(原Amaxa）Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)等電穿孔設(shè)備對RNP的轉(zhuǎn)染效率，進而提高基因編輯效率。
| 貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 1075915 |
Alt-R™ Cas9 Electroporation Enhancer, 2 nmol |
2 nmol |
電穿孔增強劑，增強轉(zhuǎn)染效率 |
| 1075916 |
Alt-R™ Cas9 Electroporation Enhancer, 10 nmol |
10 nmol |
| 10007805 |
Alt-R™ Cas9 Elec Enhancer, 100 nmol |
100 nmol |
8、HDR增強劑
Alt-R™ HDR Enhancer，小分子化合物，可提高同源重組修復(fù)概率。在包括貼壁、懸浮的大量細胞系中均有活性，可用于Cas9核酸酶、Cas12a（Cpf1）核酸酶。
| 貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 10007910 |
Alt-R™ HDR Enhancer V2, 30 µL |
30 µL |
HDR增強劑，增加同源重組修復(fù)傾向性 |
| 10007921 |
Alt-R™ HDR Enhancer V2, 150 µL |
150 µL |
| 1081072 |
Alt-R™ HDR Enhancer, 100 µL |
100 µL |
| 1081073 |
Alt-R™ HDR Enhancer, 500 µL |
500 µL |
9、供體DNA（定制）
Alt-R™ HDR供體寡核苷酸，專門為同源重組修復(fù)基因敲入開發(fā)，具有比標準寡核苷酸更高的穩(wěn)定性和更高的摻入率，可同時用于Cas9核酸酶和Cas9切口酶。
| 貨號 |
產(chǎn)品名稱 |
規(guī)格 |
備注 |
| 定制 |
Alt-R HDR Donor Oligo, 2 nmol |
2 nmol |
45-200nt，Alt-R修飾和硫代磷酸酯PS修飾 |
| 定制 |
Alt-R HDR Donor Oligo, 10 nmol |
10 nmol |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 201-500 bp, 3 µg |
3 µg |
非常適合進行段基因組的修改和插入；帶修飾雙鏈DNA |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 201-500 bp, 10 µg |
10 µg |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 501-2000 bp, 3 µg |
3 µg |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 501-2000 bp, 10 µg |
10 µg |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 2001-3000 bp, 3 µg |
3 µg |
| 定制 |
Alt-R™ HDR Donor Block, 2001-3000 bp, 10 µg |
10 µg |
IDT Alt-R™ CRISPR-Cas9實驗流程
【方法一】
1、（使用IDT序列設(shè)計工具）設(shè)計Alt-R™ crRNA，使其間隔區(qū)（Spacer）序列與DNA靶序列互補，提交給IDT定制合成crRNA；
2、將Alt-R™ crRNA與Alt-R™ tracrRNA混合，通過crRNA的重復(fù)序列區(qū)（Repeats）與tracrRNA堿基配對, 形成向?qū)NA（guide RNA，簡稱gRNA）；
3、將gRNA與Alt-R™ Cas9蛋白混勻，形成核糖核蛋白體（ribonucleoprotein，簡稱RNP)；
4、將RNP通過電轉(zhuǎn)染等導(dǎo)入細胞或細胞核；
5、通過crRNA的Spacer識別DNA靶序列，通過Cas9蛋白識別PAM序列（前間區(qū)序列鄰近基序，protospacer adjacent motif，簡稱PAM），對DNA進行剪切；
6、對DNA斷裂處進行修復(fù)
①進行非同源末端連接修復(fù)(Non-homologous end-joining，簡稱NHEJ），實現(xiàn)基因敲除（knockout）；
②（使用IDT序列設(shè)計工具）設(shè)計供體DNA模板，進行同源重組修復(fù)（Homology directed repair，簡稱HDR），實現(xiàn)基因敲入（knockoin）、基因敲除、基因沉默等。
【方法二】
1、（用IDT工具）設(shè)計sgRNA，使其Spacer與DNA靶序列互補，提交給IDT定制合成sgRNA；
2、將sgRNA與Cas9蛋白混勻，形成RNP；
3、將RNP通過電轉(zhuǎn)染等導(dǎo)入細胞或細胞核；
4、通過sgRNA的Spacer識別DNA靶序列，通過Cas9蛋白識別PAM序列，對DNA進行剪切；
5、對DNA斷裂處進行修復(fù)
①進行非同源末端連接修復(fù)，實現(xiàn)基因敲除；
②（用IDT工具）設(shè)計供體DNA模板，進行同源重組修復(fù)，實現(xiàn)基因敲入、敲除、沉默等。
IDT Alt-R™ crRNA序列設(shè)計示意圖
Alt-R™ CRISPR-Cas9優(yōu)勢
1、特別優(yōu)化的crRNA/tracrRNA/sgRNA長度，提高基因編輯性能
以HPRT基因中的12個位點為靶點，分別使用Alt-R™ crRNA:tracrRNA、Alt-R™ crRNA XT:tracrRNA、Alt-R™ sgRNA，與Alt-R™ Cas9核酸酶組裝成3種RNP，加入2μM Alt-R™ Cas9電穿孔Enhancer，轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，培養(yǎng)48小時后，通過二代測序檢測總的實驗效率，結(jié)果顯示其具有很好的穩(wěn)定性。
2、化學(xué)修飾RNA，增加核酸酶抗性，減少免疫應(yīng)答和細胞毒性
以HPRT1的12個位點為靶點，分別用Alt-R™ crRNA:tracrRNA、體外轉(zhuǎn)錄（IVT）RNA，轉(zhuǎn)染可高效表達化膿性鏈球菌Cas9蛋白的HEK-293細胞，24小時后，測定常見應(yīng)激反應(yīng)基因IFIT1（A）和OAS2（B）的表達水平。（A）qPCR顯示IVT RNA強烈誘導(dǎo)IFIT1，而Alt-R™ RNA無影響。（B）qPCR顯示IVT RNA對OAS2的誘導(dǎo)可測，而Alt-R™ RNA處于基線。同時IFITM1、RIGI、OAS1等3個應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因均得到相似結(jié)果，說明Alt-R™ RNA不會激活細胞先天免疫反應(yīng)。
3、優(yōu)化的Cas9蛋白和高保真HiFi Cas9蛋白，提供更高的特異性切割
4、電穿孔增強劑，提高轉(zhuǎn)染效率，尤其是原代細胞等較難轉(zhuǎn)染的細胞
用0.125μM-4μM RNP（Alt-R™ crRNA:tracrRNA:Cas9復(fù)合體），通過Lonza Nucleofector 核轉(zhuǎn)染K562細胞（A）、Jurkat細胞（B）、HEK-293細胞（C）時，使用電穿孔Enhancer（深藍色）、不使用（淺藍色）的效率。
5、HDR增強劑，提高同源重組修復(fù)效率
①提高多種細胞HDR
以人HPRT為靶點，使用Lonza Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，將4μM RNP（由Alt-R™ crRNA、Alt-R™ tracrRNA、Alt-R™ Cas9組裝），加入4μM Alt-R™ Cas9電穿孔Enhancer，以3μM IDT Ultramer寡核苷酸作為同源重組修復(fù)DNA模板，轉(zhuǎn)染人多種細胞系。電轉(zhuǎn)后，細胞培養(yǎng)在含30μM Alt-R™ HDR Enhancer的培養(yǎng)基中（綠色），或培養(yǎng)在含有DMSO的培養(yǎng)基中作為陰性對照（棕色），HEK-293、HeLa培養(yǎng)48小時，Jurkat、K562培養(yǎng)72小時，通過限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、靶序列PCR進行HDR分析，顯示Alt-R™ HDR Enhancer可提高多種細胞類型的同源重組修復(fù)效率。
②提高多種基因HDR
以人基因組多個位點為靶點，將4μM Alt-R™ Cas9 RNP，加入4μM Alt-R™ Cas9電穿孔Enhancer、3μM IDT Ultramer單鏈DNA模板，通過電穿孔轉(zhuǎn)染。電轉(zhuǎn)后，細胞分別培養(yǎng)在含30μM Alt-R™ HDR Enhancer的培養(yǎng)基（藍色）、含有DMSO的培養(yǎng)基（綠色）、未處理的培養(yǎng)基（棕色），48-72小時后，通過RFLP、PCR進行HDR分析，顯示Alt-R™ HDR Enhancer可提高不同基因的HDR效率。
6、在線CRISPR序列設(shè)計工具，方便地設(shè)計高質(zhì)量的crRNA/sgRNA/同源重組修復(fù)DNA模板/引物等
如物種的基因組富含A、T，或Alt-R™ CRISPR-Cas9的位點不適合，IDT同時提供CRISPR-Cas12a系統(tǒng)，盡可能滿足實驗需求。
Cas9和Cas12a系統(tǒng)區(qū)別和應(yīng)用
| IDT Alt-R™ CRISPR |
Alt-R™ CRISPR-Cas9系統(tǒng) |
Alt-R™ CRISPR-Cas12a（Cpf1）系統(tǒng) |
| Alt-R™ Cas9核酸酶 |
Alt-R™ HiFi Cas9高保真核酸酶 |
Alt-R™ Cas9 D10A切口酶 |
Alt-R™ Cas9 H840A切口酶 |
Alt-R™ dCas9蛋白 |
Alt-R™ Cas12a核酸酶 |
| 特點 |
通用Cas9酶，易于使用且經(jīng)濟實惠 |
經(jīng)序列優(yōu)化的Cas9酶，提高中靶率，降低脫靶率，高性價比 |
突變的Cas9酶，在RuvC-like結(jié)構(gòu)域中發(fā)生突變，使其缺失在非靶向鏈的切割能力 |
突變的Cas9酶，在HNH結(jié)構(gòu)域中發(fā)生突變，使其缺失在靶向鏈的切割能力 |
突變的Cas9酶，僅結(jié)合靶向DNA，缺失核酸酶切割能力 |
通用Cas12a酶，富含AT的物種，或使用CRISPR-Cas9有限制 |
| PAM識別 |
NGG |
TTTV或TTTN |
| DNA切割 |
雙鏈 |
雙鏈 |
靶向鏈 |
非靶向鏈 |
\ |
雙鏈 |
| 末端 |
平末端 |
5’突出 |
3’突出 |
\ |
5’突出 |
| 建議用途 |
一般基因編輯實驗 |
滿足大多數(shù)CRISPR基因編輯需求，兼顧效率和成本 |
適用于同時使用2種crRNA，各自識別并切割2條鏈中一條，通過將spacer由20nt提高到40nt，實現(xiàn)更高特異性 |
基因沉默，CRISPR干擾CRISPRi |
無法使用Cas9的基因編輯實驗 |
| 規(guī)格 |
100 μg或500 μg |
| Cas9+gRNA |
crRNA |
19-20nt特異性序列（推薦使用20nt），16nt通用序列 |
\ |
| tracrRNA |
67nt通用序列 |
\ |
| Cas9+sgRNA |
sgRNA |
19-20nt特異性序列（推薦使用20nt），80nt通用序列，經(jīng)過序列修飾，不會引起細胞免疫反應(yīng)，不會激活無關(guān)的基因 |
\ |
| Cas12a+crRNA |
crRNA |
\ |
20-24nt特異性序列（推薦使用21nt），20nt通用序列 |
注：
N=任意堿基
V=A、C、G
參考文獻
1. Large-scale GMP-compliant CRISPR-Cas9–mediated deletion of the glucocorticoid receptor in multivirus-specific T cells. Rafet Basar,et al.，Blood Advances (2020) 4 (14): 3357–3367
2. Partner independent fusion gene detection by multiplexed CRISPR-Cas9 enrichment and long read nanopore sequencing.Christina Stangl,et al.,Nature Communications volume 11, Article number: 2861 (2020)
3. sgRNA Sequence Motifs Blocking Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Robin Graf,et al.,Cell Reports,Volume 26, Issue 5, 29 January 2019, Pages 1098-1103.e3
4. Rapid in vitro production of single-stranded DNA. Dionis Minev,et al.，Nucleic Acids Research, Volume 47, Issue 22, 16 December 2019, Pages 11956–11962
5. Neuron-Specific Genome Modification in the Adult Rat Brain Using CRISPR-Cas9 Transgenic Rats.Susanne Bäck,et al.,Neuron,Volume 102, Issue 1, 3 April 2019, Pages 105-119.e8
6. Highly Efficient Transgenesis in Ferrets Using CRISPR/Cas9-Mediated Homology-Independent Insertion at the ROSA26 Locus.Miao Yu,et al.,Scientific Reports volume 9, Article number: 1971 (2019)
7. RNA‐guided endonuclease – in situ labelling (RGEN‐ISL): a fast CRISPR/Cas9‐based method to label genomic sequences in various species.Takayoshi Ishii,et al., New Phytol. 2019 May; 222(3): 1652–1661.
8. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells. Christopher A. Vakulskas,et al.,Naturemedicine,Published: 06 August 2018
9. Increasing Cas9-mediated homology-directed repair efficiency through covalent tethering of DNA repair template. Eric J. Aird,et al.,Communications biology, Published: 31 May 2018
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