IDT腫瘤突變負荷（TMB）解決方案
——NGS二代測序基因檢測


北京澤平代理的美國進口IDT NGS二代測序產(chǎn)品，通過文庫構建試劑盒、基因檢測Panel、定制化雜交捕獲探針組等高品質(zhì)試劑，助力腫瘤突變負荷（TMB）實驗室基礎研究。


一、背景介紹

腫瘤突變負荷（tumor mutational burden, TMB）一般指特定基因組區(qū)域內(nèi)每兆堿基對（Mb）體細胞非同義突變的個數(shù)，可以間接反映腫瘤產(chǎn)生新抗原的能力和程度，已被證實可預測多種腫瘤的免疫治療效果。近年來，越來越多的數(shù)據(jù)證實TMB越高的腫瘤，新抗原負荷越高，更有可能從免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICls）治療中獲益。

目前檢測TMB的方法主要為基于二代測序技術（NGS）的全外顯子組測序（WES）和定制靶向Panel測序。WES可檢測整個外顯子中的體細胞突變，提供腫瘤突變的圖譜，因此，WES也被認為是TMB檢測的"金標準”。同時，采用靶向Panel進行腫瘤基因組學分析已成為TMB檢測的另一種重要手段。研究人員可以根據(jù)前沿進展及臨床需求，開發(fā)針對腫瘤基因的產(chǎn)品，結合生物信息學算法快速高效地檢測腫瘤靶基因組改變。



 

 
二、IDT NGS二代測序解決方案

1、IDT xGen cfDNA & FFPE DNA 文庫制備試劑盒——建立高質(zhì)量文庫

IDT xGen cfDNA & FFPE DNA 文庫制備試劑盒，能夠?qū)ξ⒘緿NA樣本進行靈敏且準確的變異檢測。通過兩步連接法，可獲得理想的文庫轉(zhuǎn)化率，同時抑制接頭二聚體的形成。在單鏈連接的過程中可引入特異性的分子標簽（UMI）序列，以適配多種去重和錯誤校正的方法。用低質(zhì)量樣本建立高質(zhì)量文庫，助力TMB檢測。

IDT文庫制備試劑盒優(yōu)勢

①為困難樣本量身打造，更大化數(shù)據(jù)輸出；

②提升樣本轉(zhuǎn)化率，達到更高的文庫復雜度；

③結合UMI糾錯處理，實現(xiàn)低頻突變的檢測。
 


圖. IDT xGen cfDNA & FFPE DNA 文庫制備試劑盒可從不同質(zhì)量的FFPE樣本中獲得更高的文庫產(chǎn)量和文庫復雜度。使用25ng不同質(zhì)量的FFPE標準品按照IDT提供的標準流程進行文庫制備，并用61kb的定制Panel進行捕獲。

 


2、IDT xGen Exome Hyb Panel v2 全外顯子雜交捕獲探針組——高覆蓋度全外顯子組測序WES

IDT xGen Exome Hyb Panel v2 全外顯子組雜交捕獲探針組，由415,115條單獨合成且經(jīng)過質(zhì)檢的IDT xGen Custom Hyb Panel - Production 捕獲探針組成。全外顯子探針組跨越人類基因組的34Mb目標區(qū)域（19,433個基因），并且覆蓋39Mb的探針空間（即由探針覆蓋的基因組區(qū)域)）。IDT全外顯子探針使用新型“捕獲感知（capture-aware）”算法進行設計，并進行了特殊的脫靶分析，以實現(xiàn)更完整的設計覆蓋度。IDT全外顯子探針組中的所有探針均嚴格按照ISO13485標準進行生產(chǎn)，每條探針均經(jīng)過質(zhì)譜法和雙定量檢驗，保證探針的質(zhì)量及在探針庫中的濃度，是穩(wěn)定可靠的高覆蓋度WES捕獲工具。



圖. IDT外顯子探針一致的批次穩(wěn)定性，減少昂貴的重新驗證。使用100ngDNA建庫，并對8個樣本進行混合捕獲（8混)）。兩名操作人員分別在不同日期和不同地點進行捕獲。IDT埃德特的xGen Exome Hyb Panel v2 外顯子測序探針組的線性回歸線與預測的“完全”相關線高度接近，其中R2值為0.76。
 

圖. IDT xGen Exome Hyb Panel v2 全外顯子探針組在捕獲效率方面表現(xiàn)出色。根據(jù)IDT外顯子組探針捕獲實驗方案，對文庫進行捕獲和多重富集，獲得單樣本和12混（分別為IDT-1和IDT-12）捕獲的實驗結果。以Illumina NextSeq 測序儀高通量模式對2×100雙端reads進行測序。用Picard按每個文庫5Gb確定中靶堿基（選定堿基百分比)。

 

 
3、IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 探針庫——高性能捕獲探針

除WES測序外, TMB還可以通過定制化測序Panel進行檢測，這些Panel需要使用質(zhì)量可靠的捕獲探針組。IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 捕獲探針庫是帶有5'端生物素標記的DNA探針，每一條探針均經(jīng)過單獨合成、單獨質(zhì)檢，可用于二代測序?qū)嶒炛心繕薉NA序列富集。實驗證明，與市場上其他通過微陣列合成的捕獲探針相比，IDT xGen Custom Hyb Panels - Production 捕獲探針的捕獲均一性更高，GC偏好性更小，能以更少的數(shù)據(jù)投入獲得更佳的測序深度。IDT xGen Custom Hyb Panels 探針庫采用模塊化合成制備和使用，既可以獨立使用，也可以用spike-in panel 的形式與現(xiàn)有的探針庫結合使用，具有非常高的靈活性。

IDT Custom Hyb Panels - Production 探針庫優(yōu)勢

①單獨合成、單獨質(zhì)控的探針，實現(xiàn)高效、均一的目標序列富集；

②模塊化設計，實現(xiàn)經(jīng)濟、高效的定制和簡單輕松的目標序列擴充；

③嚴格質(zhì)控降低批次間差異。
 


圖.使用IDT的探針庫實現(xiàn)高度均一的目標區(qū)域覆蓋。針對標準品基因組DNA（Coriell）構建文庫，使用IDT xGen Custom Hyb Panels -Production 探針庫進行捕獲反應（目標區(qū)域為88kb）。采用Illumina NextSeq 測序儀進行測序，并對600K reads進行生信分析。結果顯示，（A）單次測序的覆蓋均一度較高；（B）同一個探針庫的兩個不同批次，顯示出較高的一致性。

 
 

三、IDT TMB成功案例



中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院團隊基于NGS Panel 檢測血液腫瘤突變負荷（bTMB），驗證了bTMB作為非小細胞肺癌患者免疫治療的生物標志物的可行性。該研究使用了IDT的定制化Panel和IDT xGen Exome Hyb Panel 進行檢測。研究納入48例晚期非小細胞肺癌外周血及腫瘤組織配對標本。NCC-GP150計算的bTMB與WES計算的TMB間的Spearman相關系數(shù)達到0.62；當bTMB≥6時，約登指數(shù)達到最佳（0.59，敏感性88%，特異性71%）。

參考文獻

Zhijie Wang. Jianchun Duan, Shangli et al. Assessment of blood tumor mutational burden as a potential biomarker for immunotherapy in patients with non-small cell lung cancer with use of a next-generation sequencing cancer gene panel. JAMA Oncol. 2019;5(5):696-702.

  


四、IDT腫瘤突變負荷相關產(chǎn)品
 

 


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