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IDT Alt-R® CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)


IDT(Integrated DNA Technologies)作為核酸定制合成領(lǐng)域的知名企業(yè),依托30年來的技術(shù)研發(fā),推出了Alt-R®系列CRISPR-Cas9基因編輯產(chǎn)品,通過對(duì)gRNA序列、Cas9核酸酶優(yōu)化,對(duì)RNP轉(zhuǎn)染效率、同源重組修復(fù)HDR效率的提升,形成了從crRNA設(shè)計(jì)到CRISPR結(jié)果檢測的一站式解決方案,讓CRISPR-Cas9系統(tǒng)更高效、更簡單。




 

 

 

 

 

 


Alt-R® CRISPR-Cas9概述

IDT的Alt-R® CRISPR-Cas9系統(tǒng),分別對(duì)crRNA、tracrRNA、sgRNA序列進(jìn)行優(yōu)化縮短、化學(xué)修飾,對(duì)化膿性鏈球菌S. pyogene Cas9內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變,獲得了高精確性的單鏈、雙鏈剪切功能,再通過電穿孔(如Lonza Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng))轉(zhuǎn)染RNP,可進(jìn)行精確地基因編輯操作。

傳統(tǒng)構(gòu)建CRISPR-Cas9質(zhì)粒的方法,質(zhì)粒大小高達(dá)6-10kb,很難轉(zhuǎn)染,而如使用原代細(xì)胞等難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率更低。且質(zhì)粒不斷產(chǎn)生CRISPR-Cas9,使脫靶率顯著增加。IDT轉(zhuǎn)染RNP蛋白復(fù)合體的方法,通過優(yōu)化CRISPR-Cas9組件,在提升剪切精確性的基礎(chǔ)上,提高轉(zhuǎn)染效率、減少細(xì)胞毒性、降低脫靶,進(jìn)而提高了基因編輯效率。




 

 

 

 

 

 

Alt-R® CRISPR-Cas9實(shí)驗(yàn)流程

【方法一】
1、(使用IDT序列設(shè)計(jì)工具)設(shè)計(jì)Alt-R® crRNA,使其間隔區(qū)(Spacer)序列與DNA靶序列互補(bǔ),提交給IDT定制合成crRNA;
2、將Alt-R® crRNA與Alt-R® tracrRNA混合,通過crRNA的重復(fù)序列區(qū)(Repeats)與tracrRNA堿基配對(duì), 形成向?qū)NA(guide RNA,簡稱gRNA);
3、將gRNA與Alt-R® Cas9蛋白混勻,形成核糖核蛋白體(ribonucleoprotein,簡稱RNP);
4、將RNP通過電轉(zhuǎn)染等導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞核;
5、通過crRNA的Spacer識(shí)別DNA靶序列,通過Cas9蛋白識(shí)別PAM序列(前間區(qū)序列鄰近基序,protospacer adjacent motif,簡稱PAM),對(duì)DNA進(jìn)行剪切;
6、對(duì)DNA斷裂處進(jìn)行修復(fù)
①進(jìn)行非同源末端連接修復(fù)(Non-homologous end-joining,簡稱NHEJ),實(shí)現(xiàn)基因敲除(knockout);
②(使用IDT序列設(shè)計(jì)工具)設(shè)計(jì)供體DNA模板,進(jìn)行同源重組修復(fù)(Homology directed repair,簡稱HDR),實(shí)現(xiàn)基因敲入(knockoin)、基因敲除、基因沉默等。








 

 

 


【方法二】
1、(用IDT工具)設(shè)計(jì)sgRNA,使其Spacer與DNA靶序列互補(bǔ),提交給IDT定制合成sgRNA;
2、將sgRNA與Cas9蛋白混勻,形成RNP;
3、將RNP通過電轉(zhuǎn)染等導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞核;
4、通過sgRNA的Spacer識(shí)別DNA靶序列,通過Cas9蛋白識(shí)別PAM序列,對(duì)DNA進(jìn)行剪切;
5、對(duì)DNA斷裂處進(jìn)行修復(fù)
①進(jìn)行非同源末端連接修復(fù),實(shí)現(xiàn)基因敲除;
②(用IDT工具)設(shè)計(jì)供體DNA模板,進(jìn)行同源重組修復(fù),實(shí)現(xiàn)基因敲入、敲除、沉默等。








 

 

 

 

 

 


Alt-R® crRNA序列設(shè)計(jì)示意圖


 

 

 

 

 

 

 

 

Alt-R® CRISPR-Cas9產(chǎn)品

1、Alt-R® crRNA:由19-20nt特異性序列(定制)和16nt通用序列融合形成,相比野生型,序列更短,中靶率更高。經(jīng)化學(xué)修飾防止被細(xì)胞核糖核酸酶降解,必須與tracrRNA一起使用以形成gRNA。

類型 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 包裝
crRNA Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA 2 nmol
10 nmol
2 nmol
10 nmol
50 nmol
100 nmol


 

 

 

2、Alt-R® crRNA XT:相比Alt-R® crRNA,經(jīng)其他化學(xué)修飾,用于高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的實(shí)驗(yàn),可提高基因編輯的穩(wěn)定性。必須與tracrRNA一起使用。

 

類型 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 包裝
crRNA XT Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA XT 2 nmol
10 nmol
2 nmol
10 nmol


 

 

 

3、Alt-R® sgRNA:由crRNA和tracrRNA序列融合組成的單個(gè)RNA,含有19-20nt的特異性序列(定制)和80nt通用序列,經(jīng)化學(xué)修飾,穩(wěn)定性更高,用于高核酸酶條件或帶有Cas9 mRNA的實(shí)驗(yàn)。相比體外轉(zhuǎn)錄的sgRNA,減少細(xì)胞免疫反應(yīng),更小細(xì)胞毒性。

 

類型 產(chǎn)品名稱 規(guī)格
sgRNA Alt-R® CRISPR-Cas9 sgRNA 2 nmol
10 nmol
50 nmol
100 nmol
Custom Alt-R® CRISPR sgRNA 定制


 

 

 

4、Alt-R® tracrRNA:通用67nt序列,遠(yuǎn)遠(yuǎn)短于野生型的89nt,縮短后性能提高,經(jīng)化學(xué)修飾,具有核酸酶抗性?商峁晒鈽(biāo)記,檢測轉(zhuǎn)染效率。必須與crRNA一起使用以形成gRNA。

 

類型 產(chǎn)品名稱 特點(diǎn) 規(guī)格 貨號(hào)
tracrRNA Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA 無標(biāo)記 5 nmol 1072532
20 nmol 1072533
100 nmol 1072534
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA, ATTO 550 熒光標(biāo)記 5 nmol 1075927
20 nmol 1075928



圖.穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的HEK-293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染Alt-R® crRNA(未標(biāo)記):tracrRNA(標(biāo)記),轉(zhuǎn)染后48小時(shí),熒光顯微鏡下10倍放大。



 

 

 

5、Alt-R® Cas9核酸酶:S. pyogene來源Cas9,大腸桿菌表達(dá)純化,添加核定位序列(Nuclear localization sequence,NLS)和C端6-His標(biāo)簽。Alt-R® HiFi Cas9高保真核酸酶,經(jīng)序列優(yōu)化,提高中靶率,降低脫靶率。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9核酸酶=610pmol。

 

類型 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 貨號(hào)
cas9核酸酶 Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease V3 100 µg 1081058
500 µg 1081059
Alt-R® S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 100 µg 1081060
500 µg 1081061

 


 

 

 

6、Alt-R® Cas9切口酶:S. pyogene來源Cas9,大腸桿菌表達(dá)純化,添加核定位序列NLS和C端6-His標(biāo)簽。其中Alt-R® Cas9 D10A切口酶中RuvC-like內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域功能失活,對(duì)DNA靶向鏈進(jìn)行單鏈切割。Alt-R® Cas9 H840A切口酶,HNH結(jié)構(gòu)域失活,對(duì)非靶向鏈單鏈切割。以10μg/μL的溶液提供。100μg Cas9切口酶=610pmol。

 

類型 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 貨號(hào)
cas9切口酶 Alt-R® S.p. Cas9 D10A Nickase V3  100 µg 1081062
 500 ug 1081063
Alt-R® S.p. Cas9 H840A Nickase V3  100 µg 1081064
 500 ug 1081065


 

 

 

7、Alt-R® dCas9蛋白:S. pyogene來源Cas9,大腸桿菌表達(dá)純化,喪失內(nèi)切酶功能,添加核定位序列NLS和C端6-His標(biāo)簽。dCas9蛋白可用于CRISPRi,進(jìn)行基因下調(diào)(knockdown)等,相比RNAi,由于CRISPRi需要在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近才能發(fā)揮功能,其脫靶率遠(yuǎn)低于RNAi。Alt-R® dCas9蛋白,以10μg/μL的溶液提供。100μg dCas9蛋白=610pmol。

 

類型 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 貨號(hào)
dCas9蛋白 Alt-R® S.p. dCas9 Protein V3 100 µg 1081066
500 µg 1081067


 

 

 

8、Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer:是Cas9特異性的載體DNA,當(dāng)使用原代細(xì)胞或難轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí),可提高Lonza(原Amaxa)Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)等電穿孔設(shè)備對(duì)RNP的轉(zhuǎn)染效率,進(jìn)而提高基因編輯效率。

 

類型 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 貨號(hào)
電穿孔Enhancer Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer 2 nmol 1075915
10 nmol 1075916


 

 

 


9、Alt-R® HDR Enhancer:小分子化合物,可提高同源重組修復(fù)概率。在包括貼壁、懸浮的大量細(xì)胞系中均有活性,可用于Cas9核酸酶、Cas12a(Cpf1)核酸酶。

 

類型 產(chǎn)品名稱 規(guī)格 貨號(hào)
HDR Enhancer Alt-R® HDR Enhancer 100 µL 1081072
500 µL 1081073


 

 

 


10、Alt-R® HDR供體寡核苷酸:專門為同源重組修復(fù)基因敲入開發(fā),具有比標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸更高的穩(wěn)定性和更高的摻入率,可同時(shí)用于Cas9核酸酶和Cas9切口酶。

 

 

 

 

 

 

Alt-R® CRISPR-Cas9優(yōu)勢

1、特別優(yōu)化的crRNA/tracrRNA/sgRNA長度,提高基因編輯性能


以HPRT基因中的12個(gè)位點(diǎn)為靶點(diǎn),分別使用Alt-R® crRNA:tracrRNA、Alt-R® crRNA XT:tracrRNA、Alt-R® sgRNA,與Alt-R® Cas9核酸酶組裝成3種RNP,加入2μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer,轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞,培養(yǎng)48小時(shí)后,通過二代測序檢測總的基因編輯效率,結(jié)果顯示其具有很好的穩(wěn)定性。

 

 

 


2、化學(xué)修飾RNA,增加核酸酶抗性,減少免疫應(yīng)答和細(xì)胞毒性

以HPRT1的12個(gè)位點(diǎn)為靶點(diǎn),分別用Alt-R® crRNA:tracrRNA、體外轉(zhuǎn)錄(IVT)RNA,轉(zhuǎn)染可高效表達(dá)化膿性鏈球菌Cas9蛋白的HEK-293細(xì)胞,24小時(shí)后,測定常見應(yīng)激反應(yīng)基因IFIT1(A)和OAS2(B)的表達(dá)水平。(A)qPCR顯示IVT RNA強(qiáng)烈誘導(dǎo)IFIT1,而Alt-R® RNA無影響。(B)qPCR顯示IVT RNA對(duì)OAS2的誘導(dǎo)可測,而Alt-R® RNA處于基線。同時(shí)IFITM1、RIGI、OAS1等3個(gè)應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因均得到相似結(jié)果,說明Alt-R® RNA不會(huì)激活細(xì)胞先天免疫反應(yīng)。


 

 

 

3、優(yōu)化的Cas9蛋白和高保真HiFi Cas9蛋白,提供更高的特異性切割

 

 

 

4、電穿孔Enhancer,提高轉(zhuǎn)染效率,尤其是原代細(xì)胞等較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞

用0.125μM-4μM RNP(Alt-R® crRNA:tracrRNA:Cas9復(fù)合體),通過Lonza Nucleofector 核轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞(A)、Jurkat細(xì)胞(B)、HEK-293細(xì)胞(C)時(shí),使用電穿孔Enhancer(深藍(lán)色)、不使用(淺藍(lán)色)的實(shí)驗(yàn)效率。



 

 

 

5、HDR Enhancer,提高同源重組修復(fù)效率
①提高多種細(xì)胞HDR

以人HPRT為靶點(diǎn),使用Lonza Nucleofector核轉(zhuǎn)染系統(tǒng),將4μM RNP(由Alt-R® crRNA、Alt-R® tracrRNA、Alt-R® Cas9組裝),加入4μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer,以3μM IDT Ultramer寡核苷酸作為同源重組修復(fù)DNA模板,轉(zhuǎn)染人多種細(xì)胞系。電轉(zhuǎn)后,細(xì)胞培養(yǎng)在含30μM Alt-R® HDR Enhancer的培養(yǎng)基中(綠色),或培養(yǎng)在含有DMSO的培養(yǎng)基中作為陰性對(duì)照(棕色),HEK-293、HeLa培養(yǎng)48小時(shí),Jurkat、K562培養(yǎng)72小時(shí),通過限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、靶序列PCR進(jìn)行HDR分析,顯示Alt-R® HDR Enhancer可提高多種細(xì)胞類型的同源重組修復(fù)效率。


 

 

 


②提高多種基因HDR

以人基因組多個(gè)位點(diǎn)為靶點(diǎn),將4μM Alt-R® Cas9 RNP,加入4μM Alt-R® Cas9電穿孔Enhancer、3μM IDT Ultramer單鏈DNA模板,通過電穿孔轉(zhuǎn)染。電轉(zhuǎn)后,細(xì)胞分別培養(yǎng)在含30μM Alt-R® HDR Enhancer的培養(yǎng)基(藍(lán)色)、含有DMSO的培養(yǎng)基(綠色)、未處理的培養(yǎng)基(棕色),48-72小時(shí)后,通過RFLP、PCR進(jìn)行HDR分析,顯示Alt-R® HDR Enhancer可提高不同基因的HDR效率。


 

 

 


6、在線CRISPR序列設(shè)計(jì)工具,方便地設(shè)計(jì)高質(zhì)量的crRNA/sgRNA/同源重組修復(fù)DNA模板/引物等

 

 

 

 

 

 


如物種的基因組富含A、T,或Alt-R® CRISPR-Cas9的位點(diǎn)不適合,IDT同時(shí)提供CRISPR-Cas12a系統(tǒng),盡可能滿足基因編輯需求。

Cas9和Cas12a系統(tǒng)區(qū)別和應(yīng)用

 

IDT Alt-R® CRISPR Alt-R® CRISPR-Cas9系統(tǒng) Alt-R® CRISPR-Cas12a(Cpf1)系統(tǒng)
Alt-R® Cas9核酸酶 Alt-R® HiFi Cas9高保真核酸酶 Alt-R® Cas9 D10A切口酶 Alt-R® Cas9 H840A切口酶 Alt-R® dCas9蛋白 Alt-R® Cas12a核酸酶
特點(diǎn) 通用Cas9酶,易于使用且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠 經(jīng)序列優(yōu)化的Cas9酶,提高中靶率,降低脫靶率,高性價(jià)比 突變的Cas9酶,在RuvC-like結(jié)構(gòu)域中發(fā)生突變,使其缺失在非靶向鏈的切割能力 突變的Cas9酶,在HNH結(jié)構(gòu)域中發(fā)生突變,使其缺失在靶向鏈的切割能力 突變的Cas9酶,僅結(jié)合靶向DNA,缺失核酸酶切割能力 通用Cas12a酶,富含AT的物種,或使用CRISPR-Cas9有限制
PAM識(shí)別 NGG TTTV或TTTN
DNA切割 雙鏈 雙鏈 靶向鏈 非靶向鏈 \ 雙鏈
末端 平末端 5’突出 3’突出 \ 5’突出
建議用途 一般基因編輯實(shí)驗(yàn) 滿足大多數(shù)CRISPR基因編輯需求,兼顧效率和成本 適用于同時(shí)使用2種crRNA,各自識(shí)別并切割2條鏈中一條,通過將spacer由20nt提高到40nt,實(shí)現(xiàn)更高特異性 基因沉默,CRISPR干擾CRISPRi 無法使用Cas9的基因編輯實(shí)驗(yàn)
規(guī)格 100 μg或500 μg
Cas9+gRNA crRNA 19-20nt特異性序列(推薦使用20nt),16nt通用序列 \
tracrRNA 67nt通用序列 \
Cas9+sgRNA sgRNA 19-20nt特異性序列(推薦使用20nt),80nt通用序列,經(jīng)過序列修飾,不會(huì)引起細(xì)胞免疫反應(yīng),不會(huì)激活無關(guān)的基因 \
Cas12a+crRNA crRNA \ 20-24nt特異性序列(推薦使用21nt),20nt通用序列

注:
N=任意堿基
V=A、C、G
 

 


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